Aeromonas hydrophila độc hại trong cá da trơn

Sự xuất hiện vi khuẩn ăn thịt người-Aeromonas hydrophila độc hại (VAH) đã được chứng minh là do dịch MAS (Hình 1). Cho đến nay, các điều kiện cơ bản hoặc rõ ràng dẫn đến sự bùng phát dịch bệnh này phần lớn không rõ và thực tiễn quản lý đã không thể hạn chế hoặc ngăn chặn sự bùng phát.

Cảm ứng của MAS trong các thử nghiệm có thể hỗ trợ trong việc đánh giá độc lực của các chủng phân lập A. hydrophila, đánh giá yếu tố ảnh hưởng và phát triển phương pháp phòng chống MAS. Hiện nay, tiêm trong màng bụng (IP) (tức là cung cấp tế bào vi khuẩn vào khoang màng bụng bằng ống tiêm và kim tiêm) là phương pháp được sử dụng trong phòng thí nghiệm để so sánh độc lực tương đối của A. hydrophila phân lập và kiểm tra hiệu quả của việc tiêm chủng phòng chống MAS.

Thách thức thông qua tiêm IP thì có hiệu quả và tái sản xuất, nhưng bỏ qua bảo vệ bẩm sinh của cá (tức là da và chất nhầy). Một phương pháp thử thách là ngâm cá trong nước có chứa các tế bào VAH. Thực hành này, được xem là thách thức ngâm qua đường nước nhiễm trùng và là sự nhiễm độc tự nhiên hơn. Đến nay, tỷ lệ tử vong qua phương pháp này là thấp ngay cả ở nồng độ vi khuẩn VAH rất cao.

Các yếu tố dẫn đến MAS chưa được xác định bằng phương pháp đường nước. Kết quả từ cuộc nghiên cứu cho thây rằng các yếu tố tiềm năng được điều tra dẫn đến tăng sự nhạy cảm ở cá tra nhiễm VAH và thiết lập phương tái sản xuất MAS nhân tạo bằng đường nước.

Cá và nuôi cấy vi khuẩn

Cá da trơn (Delta Select) được sử dụng trong nghiên cứu này lấy từ Đơn vị nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản nước ấm, Bộ Nông nghiệp Mỹ-ARS, Stoneville (Mississippi, Mỹ) và nuôi giống (trọng lượng khoảng 22 - 35 g). Cá được duy trì trong bể 114 L (khoảng 100 con / bể) với nước ấm (27 ± 1ºC) nước khử clo với tốc độ dòng chảy 0,5-0,6 lít /phút.

Ba chủng độc lực của A. hydrophila (ML-10-51K, AL09-71 = ML09-119 và ML-10-208K) thu được từ cá tra bị bệnh với các dấu hiệu điển hình của MAS đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Các vi khuẩn được nuôi trong nước đậu nành tryptic tại 28ºC và lắc liên tục tại 200 rpm cho đến khi mật độ tế bào đạt đến khoảng 2 x 109 tế bào /ml. Đối với những thách thức gây bệnh thực hiện trong nghiên cứu này, các tế bào vi khuẩn được nhân giống trong TSB sử dụng cùng một lượng vi khuẩn cấy với tỷ lệ tiêm chủng 100 ml cho mỗi vi khuẩn trung bình 100 ml.

Ảnh hưởng của vết thương dẫn đến cá chết

Các phương pháp điều trị sau đây đã được tiến hành để đánh giá hiệu quả của lưới và gây thương tích làm cá chết: 1) di chuyển và giữ nhẹ: Cá được chuyển từ bể nuôi đến bể thử nghiệm 50-L (10 con / bể) sử dụng tấm lưới dài 8-inch (20-cm). Bốn mươi tám giờ sau khi chuyển giao, lưu lượng nước được tắt và mức nước hồ đã giảm xuống còn 15-L.

Cá được thử thách với VAH ở nồng độ 2,0 ± 0,06 x 107 cfu / ml bể nước. Sau một giờ, lưu lượng nước được mở lại. Có 6 lần lặp lại đối với A. hydrophila và 3 cho cuộc thử nghiệm (bằng cách thêm 100 ml TSB không được nuôi); 2) Trầy da: Cá được chuyển nhẹ nhàng trong cùng một cách như được mô tả ở phương pháp 1 vào một xô đầy khoảng 20-L nước chứa 100 mg / L tricaine methanesulfonate (MS-222). Cá không di chuyển bị làm trầy nhẹ ở một bên đuôi (qua khoảng 2,0-2,5 cm) bằng cách sử dụng 4-ct xói Pad.

Bùng phát A. hydrophila độc trong một ao cá ở phía tây Alabama. Ảnh bởi Bill Hemstreet.

Mười con cá bị trầy đã được đưa vào một bể chứa đầy 15 lít nước. Có sáu bể giống nhau, ba trong số đó có chứa VAH và ba bể còn lại được sử dụng thí nghiệm trong 1 giờ; 3) Cắt mỡ vây cá: Cá được chuyển đến và gây mê trong xô như mô tả ở phương pháp 2. Dùng kéo cắt mỡ vây, nằm giữa vây lưng và vây đuôi (khoảng 80-85 phần trăm vây được cắt).Có tổng cộng 80 con cá bị cắt vây (Af) được phân phát như nhau thành tám bể 50 lít chứa đầy 15 lít nước, trong đó có bốn bể chứa VAH và bốn bể khác cũng vậy. Số cá chết trong tất cả các phương pháp điều trị ở trên và các thí nghiệm sau đây được theo dõi hàng ngày trong hai tuần.

Ảnh hưởng của nồng A. hydrophila làm cá chết

Mỗi bể 50 lít đã được đổ đầy 15 lít nước và nhận được 10 cá cắt Af. Cá trong bể được thử thách với sáu nồng độ tế bào VAH khác nhau trong 100 ml TSB, dẫn đến 2 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, và 2 x 107 cfu/mL bể nước. Có ba lần lặp lại cho mỗi nồng độ. Lưu lượng nước được hoạt động lại sau thử thách một tiếng.

Đánh giá hiệu quả của mô hình thử thách đường nước với cá cắt vây

Bốn chủng Aeromonas đặc trưng được sử dụng để đánh giá hiệu quả của mô hình đường nước. Trong số những chủng phân lập, ML-10-51K, AL09-71 và ML-10-208K được biết đến là A. hydrophila độc lực. Sự gây bệnh của ALG10-089 (A. veronii) thì vẫn chưa rõ. Trong thử nghiệm này, 20 cá cắt vây được thêm vào bể 50 lít chứa đầy 15 lít nước (27 ± 1ºC). Mỗi con cá được thử thách bằng cách thêm 100 ml TSB (với khoảng 3 x 109 cfu / ml). Lưu lượng nước được phục hồi sau 1 h thách thức. Có ba bể giống nhau cho mỗi chủng phân lập. Tỷ lệ tử vong do mỗi chủng được ghi nhận và phần trăm tỷ lệ tử vong đã được tính toán sau 14 ngày thử thách.

Ảnh hưởng của việc xử lý cá và vết thương dẫn đến cá chết

Như thể hiện ở Bảng 1, VAH không làm chết cá đã được chuyển nhẹ nhàng và giữ trong bể trong 48 giờ trước khi thử thách. Vết thương do con người gây ra ở da cá do trầy, mặc dù không có chấn thương rõ ràng nhưng làm tăng đáng kể tỷ lệ tử vong (20 phần trăm). Vết thương do cắt các vây dẫn đến khoảng 90 phần trăm tỷ lệ tử vong khi ngâm nước với VAH. Tất cả cá bệnh và sắp chết sẽ xuất hiện vây đỏ, bên ngoài / bên trong nhiễm trùng huyết, và xuất huyết iridial, dấu hiệu lâm sàng điển hình của hoạt lực Aeromonas nhiễm trùng huyết (MAS) quan sát thấy trong cá bệnh từ các trại nuôi thủy sản (ví dụ, trong lĩnh vực này - Hình 2). Cá cắt vây bơi và cho ăn bình thường, không có viêm ở các vây bị cắt và còn sống sau khi điều trị.

Zhang, Bảng 1

Phương pháp	Thử thách	Số lần lặp lại	Số lượng cá	Tỷ lệ tử vong tích lũy (%±SD)
Di chuyển nhẹ và giữ trong 2 ngày	TSB trung bình  A. hydrophilia	3 6	30 60	0 0
Trầy da	TSB trung bình  A. hydrophilia	3 3	30 30	0 20.0±0.0
Cắt bỏ mỡ vây	TSB trung bình  A. hydrophilia	4 4	40 40	0 90.0±7.1

Ảnh hưởng của việc xử lý và vết thương làm cá chết do nhiễm độc hydrophily A..

Ảnh hưởng của nồng A. hydrophila làm cá chết

Cá cắt Af chết liên quan đáng kể tới nồng độ VAH (Hình 3). Tại 2 x 105 cfu / ml, không làm cá chết trong khi số lượng cá chết tăng từ 20 phần trăm đến 90 phần trăm khi nồng độ VAH tăng từ 1 x 106 đến 2 x 107 cfu / ml. Liều gây chết trung bình (LD50) là 3.2 x 106 cfu / ml với 95 phần trăm, từ 2.3 x 106 đến 4.4 x 106 cfu/mL.

Đánh giá các mô hình thử thách đường nước với cá bị cắt vây

Trong số bốn phân lập được thử nghiệm, ML-10-51K, AL09-71 và ML-10-208K có cùng độ kết dính với cá tra có huyết thanh miễn dịch để chống lại ML-10-51K, một chủng VAH (Bảng 2). Ba chủng có tỷ lệ tử vong ≥ 88 phần trăm trong vòng 72 tiếng dưới nước (Bảng 2). Quan sát cho thấy A. veronii, ALG10-089 không có phản ứng kết dính và không gây tử vong trong hai tuần.

Zhang, Bảng 2

Các chủng	Tỷ lệ tử vong (%±SD)	Độ kết dính	Nhận dạng
ML-10-51K	90±5	64	A. hydrophila
AL-09-71	88±3	64	A. hydrophila
ML-10-208K	90±5	64	A. hydrophila
ALG10-089	0	<2	A. veronii

Tỷ lệ chết của cá da trơn cắt vây sau khi thách thức với các chủng Aeromonas hydrophila và A. veronii (ALG-10-089). Tỷ lệ tử vong được tích lũy ở hai tuần sau thử thách. Cá da trơn có huyết thanh miễn dịch với các sản phẩm ngoại bào của chủng ML-10-51K và được sử dụng trong khảo nghiệm kết dính.

Triển vọng

Kết quả cho thấy rằng vết thương trên bề mặt cá là một yếu tố chính dẫn đến nhiễm trùng VAH. Cá được di chuyển có thể không bị nhiễm trùng nếu thực hiện trong hai ngày (có thể do chữa lành vết thương và / hoặc giảm stress) trước khi thách thức, cá có vết thương mới dễ bị nhiễm hơn. Một khảo sát các yếu tố nguy cơ bùng phát Aeromonas hydrophila cho thấy, ao nuôi cá tra được đánh bằng lưới kéo thì dễ bùng phát dịch MAS hơn hai lần trong một năm. Quan sát này ám chỉ rằng cá có thể bị thương do đánh cá bằng lưới và dễ bị nhiễm trùng A. hydrophila. Từ những nghiên cứu trước đây, chúng tôi lưu ý rằng nhiễm ký sinh trùng có thể dẫn đến hủy hoại da và mang cá, tăng cường vi khuẩn xâm nhập, và sau đó tăng tỷ lệ cá chết.

Để xác minh phản ứng của vết thương khi nhiễm A. hydrophila thì một vết thương đã được tạo ra nhân tạo bằng cách cắt một phần vây của cá da trơn đang bơi và kiếm ăn bình thường trong bể và không có tử vong được quan sát thấy trong phương pháp (kiểm soát) thí nghiệm . Tuy nhiên, cá cắt vây rất dễ bị nhiễm trùng VAH và cá bệnh có dấu hiệu lâm sàng điển hình của MAS.

Tóm lại, các vết thương trên bề mặt cơ thể sống có thể là một điều kiện tiên quyết đối với nhiễm VAH qua đường nước. Các loại vết thương bề mặt, có thể dẫn đến tổn thương chất nhầy trên da, làm cho cá dễ bị nhiễm mầm bệnh cơ hội trong một mức độ nào đó. Những kết quả này cho thấy mô hình thách thức đường nước trong nghiên cứu có thể phát triển hiệu quả lĩnh vực này trong các điều kiện thí nghiệm để tái tạo MAS do nhiễm VAH ở cá da trơn. Mô hình đường nước thách thức sẽ tạo điều kiện nghiên cứu khẩn trương cần thiết để phòng chống MAS (như tránh vết thương và chữa bệnh) và kiểm soát (chẳng hạn như tiêm chủng phòng bệnh, sàng lọc chế phẩm sinh học và điều trị kháng sinh).