Đặc điểm của vi khuẩn đường ruột ở tôm sú trưởng thành tự nhiên và thuần dưỡng - Phần 1

Tôm sú là loài giáp xác biển có tầm quan trọng về mặt kinh tế trên thị trường thế giới. Để đảm bảo tính bền vững của ngành tôm thì năng lực sản xuất và công tác phòng chống dịch bệnh phải được cải thiện. Công trình này do Wanilada Rungrassame và cộng sự, Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc gia (BIOTEC), Thái Lan cung cấp báo cáo toàn diện đầu tiên về quần thể vi khuẩn trong đường ruột của tôm sú trưởng thành và cho thấy một số thành viên vi khuẩn tương tự giữa đường ruột của tôm sú được đánh bắt tự nhiên và tôm sú thuần dưỡng.

Giới thiệu

Đặc điểm của hệ vi sinh vật trong ruột động vật là vấn đề trọng tâm trong việc nâng cao tầm hiểu biết về mối quan hệ giữa vật chủ và vi sinh vật. Các cộng đồng vi sinh vật ở người và chuột được ước tính bao gồm >1,000 đơn vị phân loại. Trong khi có một số vi khuẩn có thể gây bệnh cho vật chủ của chúng thì cũng có các loài vi sinh vật cộng sinh khác có lợi cho quá trình phát triển và chức năng sinh lý của vật chủ, đóng vai trò hấp thụ chất dinh dưỡng, phản ứng miễn dịch và phát triển biểu mô. Duy trì sự cân bằng trong quần thể vi khuẩn đường ruột là điều rất quan trọng đối với sức khỏe của vật chủ. Đổi lại, một số yếu tố của vật chủ (chẳng hạn như chế độ ăn, giai đoạn phát triển và tình trạng sinh lý) đã được xác định để tác động đến thành phần vi khuẩn đường ruột. Vật chủ bằng hệ thống miễn dịch đường ruột và môi trường ruột của chúng (ví dụ: độ pH và axit trong mật), cũng định hình được thành phần của vi khuẩn đường ruột để duy trì mức độ đa dạng tương đối ổn định.

Ngoài việc hiểu được mối quan hệ giữa vật chủ và hệ vi sinh vật thì việc xác định đặc điểm của vi khuẩn đường ruột sẽ giúp xác định được vi khuẩn có tiềm năng trở thành các lợi khuẩn, mà các lợi khuẩn này được sử dụng ngày càng nhiều như một phương tiện thay thế cho y tế dự phòng ở người và động vật. Đối với ngành chăn nuôi thủy sản, khái niệm thay thế việc sử dụng thuốc kháng sinh bằng men vi sinh (lợi khuẩn) sẽ giúp ngăn ngừa ô nhiễm môi trường và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Thật vậy, một số nghiên cứu đã phát triển các ứng dụng về lợi khuẩn dành cho nuôi trồng thủy sản. Điều này cũng không ngoại lệ đối với tôm sú (Penaeus monodon), đây là loài giáp xác biển có tầm quan trọng về mặt thương mại trong vài thập kỷ qua ở nhiều nước châu Á và châu Úc (Australia). Cùng với mức tiêu thụ tôm ngày càng cao thì việc khai thác tự nhiên giảm xuống đã buộc hoạt động thuần dưỡng trở thành nguồn sản xuất tôm chính. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi đang bị suy thoái do một số yếu tố, đặc biệt là do sự bùng phát dịch bệnh.

Là một phương tiện thay thế để giải quyết vấn đề bùng phát dịch bệnh, việc kiểm soát dịch bệnh bằng cách sử dụng lợi khuẩn hoặc duy trì sự cân bằng vi khuẩn đường ruột khỏe mạnh đòi hỏi sự hiểu biết toàn diện về sự đa dạng của vi khuẩn trong đường ruột của động vật thủy sản thường được chăn nuôi. Mặc dù đã có một số nghiên cứu về sự đa dạng của vi khuẩn ở các loài thủy sản thường được chăn nuôi từ tự nhiên như tép bạc (P. merguiensis), cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar L), cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua L) và cá ngựa vằn (Danio rerio), nhưng có rất ít phát hiện về vi khuẩn đường ruột của tôm sú (P. monodon). Chỉ gần đây các nghiên cứu về sự đa dạng của vi khuẩn trong đường ruột của tôm sú ở giai đoạn tôm giống và tôm con đã được báo cáo, chưa có báo cáo nào về vi khuẩn đường ruột của tôm sú được đánh bắt tự nhiên (loài ăn các loài sinh vật đáy di chuyển chậm như cua nhỏ, tôm, nhuyễn thể và giun nhiều tơ). Ngược lại, tôm thuần dưỡng trong các cơ sở chăn nuôi được cho ăn thức ăn viên công nghiệp và được chăn nuôi độc canh dưới mật độ thả nuôi cao hơn. Khi so sánh sự khác biệt về vi khuẩn đường ruột của tôm được đánh bắt tự nhiên và tôm được thuần dưỡng có thể tiết lộ những thay đổi về hình dạng cụ thể của vi khuẩn đường ruột do nuôi trồng thủy sản. Những thay đổi này có ý nghĩa đối với sức khỏe của tôm và do đó, việc ứng dụng kiến thức này có thể cải thiện tỷ lệ sống sót của tôm sú trong quá trình thuần dưỡng.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra các quần thể vi khuẩn có liên quan đến đường ruột của tôm sú trưởng thành được đánh bắt tự nhiên và tôm sú trưởng thành được thuần dưỡng bằng cách sử dụng phương pháp phân tích hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" thông lượng cao song song với điện di DNA biến tính trên gel gradient (DGGE). Sự tương đồng và khác biệt về vi khuẩn đường ruột giữa tôm tự nhiên và tôm thuần dưỡng cung cấp bằng chứng ban đầu cho cộng đồng vi khuẩn cốt lõi cũng như các ứng cử viên lợi khuẩn đối với tôm sú.

Các kết quả

Tổng quan về phân tích phương pháp giải trình tự hệ gen 16S rRNA

Phương pháp giải trình tự hệ gen rRNA 16S dựa trên nguyên lý “đọc trình tự bằng tổng hợp” được sử dụng để xác định quần thể vi khuẩn trong đường ruột của sáu cá thể tôm trưởng thành từ môi trường sống hoang dã (WC, n = 3) và thuần dưỡng (DB, n = 3) (Hình 1). Tổng số 61,499 lượt đọc thu được từ quá trình giải trình tự vùng V3-4 của hệ gen 16S rRNA (Bảng 1). Các mã vạch đã được gán các trình tự vào các thư viện riêng biệt: WC1 (5,029 trình tự), WC2 (9,969 lượt đọc), WC3 (11,532 lượt đọc), DB1 (2,961 lượt đọc), DB2 (3,190 lượt đọc) và DB3 (1,009 lượt đọc). Các chuỗi được tập hợp thành các đơn vị phân loại hoạt động (OTUs) ở 0.03 các mức độ không giống nhau mà trong đó mỗi OTU đại diện cho một kiểu loài duy nhất. Tổng số OTU dao động từ 138 đến 806, trong đó nhóm WC thể hiện sự thay đổi về số lượng OTU cao hơn. Các OTU được phân loại thêm theo cấp độ chi bằng cách sử dụng Bộ phân loại RDP II. Tất cả sáu cộng đồng vi khuẩn đều chứa năm ngành (phyla): Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria và Proteobacteria. DB1 từ nhóm DB có số lượng chi vi khuẩn thấp nhất (21, 43 và 28 chi tương ứng cho DB1, DB2 và DB3), trong khi số lượng chi vi khuẩn cao nhất được phát hiện trong WC2 từ nhóm WC (39, 89, và 52 chi tương ứng cho WC1, WC2 và WC3).

Bảng 1. Tóm tắt kết quả phân tích giải trình tự DNA dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp", mức độ đa dạng của vi khuẩn (OTU), mức độ bao phủ của mẫu vật (Mức độ bao phủ của Good), chỉ số đa dạng (Shannon) và mức độ phong phú OTU ước tính (Chao1) để phân tích sự đa dạng của vi khuẩn đường ruột ở tôm sú được đánh bắt tự nhiên (WC, n = 3 ) và tôm sú thuần dưỡng (DB, n = 3).

Để ước tính và so sánh sự đa dạng của vi khuẩn trong từng cá thể tôm, các chỉ số đa dạng của vi khuẩn được tính toán từ các OTU của mỗi thư viện. Các chỉ số về độ bao phủ của Good (được sử dụng để ước tính phần trăm tổng số OTU của vi khuẩn đại diện có trong một mẫu) nằm trong khoảng từ 0.90–0.97, cho thấy kết quả gen 16S rRNA từ mỗi thư viện đại diện cho phần lớn vi khuẩn trong đường ruột của tôm. Tính đa dạng của vi khuẩn được ước tính bởi chỉ số Shannon dao động từ 2.45 đến 3.21 ở nhóm WC và từ 2.61–3.58 ở nhóm DB, điều này cho thấy mức độ đa dạng tương tự nhau giữa hai môi trường. Phân tích Chao1 về độ phong phú của vi khuẩn ước tính có khoảng 597 đến 2,454 kiểu loài, con số này cao hơn số OTU thực tế được quan sát thấy trong mỗi thư viện, điều này cho thấy rằng mức độ đa dạng vi khuẩn thực sự trong ruột của tôm sú đã bị đánh giá không đúng mức. Ngoài ra, việc phân tích phân đoạn hiếm được thực hiện để xác định xem liệu các OTU từ mỗi thư viện đã được thu thập đầy đủ từ việc phân tích phương pháp giải trình tự DNA dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" (Hình 2). Phù hợp với bảng phân tích Chao1, các đường cong phân đoạn hiếm đối với nhóm WC (Hình 2A) và DB (Hình 2B) không ổn định, điều này cho thấy rằng mức độ phong phú của vi khuẩn trong đường ruột của tôm sú trưởng thành vẫn chưa được xác định. Vẫn cần lấy mẫu trình tự bổ sung để nắm bắt được sự đa dạng vi khuẩn đường ruột thực sự của tôm sú trưởng thành. Ngay cả khi có sự trợ giúp từ kỹ thuật giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp", có một nghiên cứu sinh thái học về vi sinh vật nhằm để hé lộ bức tranh toàn cảnh về các cộng đồng vi khuẩn vẫn còn rất nhiều thách thức. Ví dụ, trong các phân tích về cộng đồng vi khuẩn trong lòng đất, các đường cong phân đoạn hiếm không bị bão hòa, ngay cả khi thu được khoảng từ 5,000 đến 10,000 lượt đọc kết quả giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp".

Hình 2. Phân tích phân đoạn hiếm của ruột tôm.

Các đơn vị phân loại hoạt động (OTU) được phân nhóm dựa trên 97% giống nhau về trình tự đối với (A) nhóm đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và (B) nhóm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3). Số lượng trình tự được lấy mẫu đại diện cho số lần đọc trình tự dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp".