Hiệu quả của chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus

Hiệu quả của chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus trong việc chống lại vi khuẩn Vibrio trên tôm sú

Vi khuẩn gây bệnh có thể gây ra một loạt các vấn đề, từ việc tăng trưởng chậm đến chết hàng loạt. Vi khuẩn Vibrio spp. là vi khuẩn phổ biến trong các môi trường nước nước ngọt, nước lợ và nước mặn. Vi khuẩn Vibrio spp. là những vi khuẩn gây bệnh quan trọng nhất trong nuôi tôm và chúng có thể gây tử vong cho tôm đến 100%. Việc sử dụng thuốc kháng sinh, chất hóa học để kiểm soát mầm bệnh đã dẫn đến các vi sinh vật kháng thuốc. Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ngày càng được quan tâm.

Chế phẩm sinh học được sử dung như nguồn thức ăn bổ sung trong nuôi trồng thủy sản và có vai trò cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, kích thích tăng trưởng, cung cấp dinh dưỡng và tăng sức đề kháng chống lại các tác nhân gây bệnh. Các chế phẩm sinh học có thể ngăn chặm mầm bệnh bám vào ruột bằng cách sản xuất chất kháng khuẩn. Các loại chế phẩm sinh học đã được kiểm nghiệm để có thể sử dụng trong nuôi tôm bao gồm lợi khuẩn, nấm men và vi tảo. Lactobacillus là loài vi khuẩn lactic đã được sử dụng như chế phẩm sinh học trong nuôi tôm. Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Lactobacillus có lợi trong việc hấp thu dinh dưỡng và chống lại các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, chưa có dòng chế phẩm sinh học nào có hiệu quả hoàn toàn trong việc chống lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus khi nuôi tôm với quy mô lớn. Vì vậy, một nghiên cứu đã được tiến hành tại Ấn Độ để khám phá hiệu quả của dòng chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus trong việc chống lại các loại vi khuẩn Vibrio sp. alginolyticus trong tôm sú ấu niên.

Phương pháp nghiên cứu

Dòng chế phẩm sinh học

Trong nghiên cứu này, dòng chế phẩm sinh học L. acidophilus được phân lập từ pho mát bằng cách pha loãng mẫu và tán đều trên môi trường MRS. Nó được nhận dạng bằng cách sử dụng các kỹ thuật sinh lý học và hình thái học. Các dòng vi khuẩn Vibrio như Vibrio parahaemolyticus SAC 01, Vibrio cholerae SAC 04, Vibrio harveyi SAC 09 và V. alginolyticus SAC 15 được phân lập từ phòng thí nghiệm vi sinh tại Đại học Srimad Andavan Arts and Science College và được chứa trong  Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS) ở nhiệt độ 4°C.

Thử nghiệm hoạt động chống vi khuẩn

Vi khuẩn L. acidophilus 04 nuôi trong môi trường MRS broth được quay li tâm ở 10.000g trong 10 phút với nhiệt độ 30oC. Phần dịch nổi trên bề mặt được khử trùng bằng lọc qua bộ lọc có kích thước 0.25 µM và được trung hòa ở dung dịchpH 7.0. Các dòng vi khuẩn Vibrio được nuôi trong môi trường thạch dinh dưỡng TSA với 1.0% NaCl trong 12 giờ ở nhiệt độ 30°C. Đổ 100 µL vi khuẩn V. parahaemolyticus SAC 01, V. cholerae SAC 04, V. harveyi SAC 09 and V. alginolyticus SAC 15 lên các đĩa Mueller-Hinton agar. Đĩa tiệt trùng và được làm khô có kích thước 6mm, chứa 20 µL dịch nổi trên bề mặt đã được lọc được đặt lên trên các đĩa này. Các đĩa có chứa MRS broth (pH 6.5) được sử dụng như là yếu tố kiểm soát để xác định hoạt động kiềm chế của vật mang.

Chuẩn bị thức ăn

Dòng chế phẩm sinh học L. acidophilus 04 được nuôi trong MRS broth và được ủ liên lục ở nhiệt độ 30°C qua đêm. Sau khi ủ, các tế bào được tách ra bằng cách quay li tâm (2000 g) và được rửa sạch hai lần bằng dung dịch muối đệm phosphate (pH 7.2). Chất hút bám ở 600 nm được điều chỉnh dao động 0.25 ± 0.05 để làm chuẩn hóa số lượng vi khuẩn (106 to 107 CFU mL-1). Thức ăn công nghiệp được sử dụng cho tôm ăn như nguồn thức ăn cơ bản để bổ sung vi khuẩn L. acidophilus 04. Số lượng chế phẩm sinh học Lactobacillus trong thức ăn được xác định bằng đĩa chuẩn  Plate Count Agar (Standard Methods Agar).

250 ấu trùng tôm sú được lấy từ một trại tôm thương mại ở Thanjur, Ấn Độ. Tôm được làm cho thích nghi với môi trường trong vòng 7 ngày. Lúc này, trọng lượng trung bình của tôm là 0.56 ± 0.02 g và tôm được chia ra và được đưa vào trong 9 bể chứa bằng nhựa có dung tích 50l, mỗi bể gồm 25 tiin ấu niên. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức: nghiệm thức 1 bổ sung L. acidophilus 04 với mật độ 106 CFU g-1 thức ăn, nghiệm thức 2 bổ sung L. acidophilus với mật số 107 CFU/ g-1 thức ăn. Nghiệm thức 3 không bổ sung L. acidophilus. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Tôm trong các nhóm nghiệp thức đều được cho ăn 2 lần/ngày. Nhiệt độ nước được giữ ở mức  28 ± 1°C trong suốt quá trình thử nghiệm. Thời gian thử nghiệm là 30 ngày. Trọng lượng và tỷ lệ sống của tôm được theo dõi, ghi chép và được lấy ra để thử nghiệm vi sinh vật vào ngày thứ 30. Tất cả tôm trong các bể chứa được thử thách với vi khuẩn V. alginolyticus (105 CFU ml-1) trong 10 ngày. Tất cả vi khuẩn, tổng số Vibrio và L. acidophilus từ đường ruột của tôm và nước trong bể chứa được ghi lại trước và sau khi thử thách vi khuẩn vibrio.

Kết quả

Hoạt động kháng khuẩn

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt động kháng khuẩn của L. acidophilus được đánh giá là có khả năng chống lại 4 vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Vòng kháng khuẩn từ 10-16mm. Vòng kháng khuẩn của L. acidophilus lên V. alginolyticus cao nhất là 18mm, đối với V. cholerae nhỏ nhất (8-12mm).

Ảnh hưởng của dòng chế phẩm đến tỷ lệ sống và trọng lượng tôm

Có sự khác nhau cơ bản trong trọng lượng và tỷ lệ sống của tôm giữa các nghiệm thức. Trọng lượng tôm ở nghiệm thức 2 cao nhất 1,43 g/con, ở nghiệm thức đối chứng thấp nhất 1,02 g/con. Tỷ lệ tôm chết khi cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio của tôm thấp nhất ở nghiệm thức 1 và 2 (20%), trong khi đó nghiệm thức đối chứng tỷ lệ chết lên đến 86,67%.

Số vi khuẩn và Lactobacillus trong ruột tôm cao hơn ở nghiệm thức có bổ sung L. acidophilus. Mật số vi khuẩn tổng trong ruột tôm đã khác biệt ngay từ tuần thứ 2 của thí nghiệm và cho đến kết thúc thí nghiệm. Lúc đầu, sự hiện diện của L. acidophilustrong ruột tôm là không đáng kể; tuy nhiên, số vi khuẩn L. acidophilus bắt đầu gia tăng đáng kể (p<0,05) đối với các nghiệm thức cho ăn thức ăn có bổ sung L. acidophilus. Mật số vi khuẩn tổng trong môi trường nước ở nghiệm thức 1 cao nhất (2 ± 0,02 × 10^3đến 7,2 ± 0.2 × 10^8 CFU/mL), kế đó là nghiệm thức 2 (1,6 × 10^3 đến 6.1 ± 0,63 × 10^8 CFU/mL) và nghiệm thức đối chứng thấp nhất, dao động từ 1,5 ± 0,2 × 10^3 đến 3,6 ± 0,2 x10^8 CFU/mL.

Có sự khác biệt đáng kể giữa tổng mật số vi khuẩn L. acidophilus ở nghiệm thức 1 và 2 từ 15 đến 30 ngày thí nghiệm. Sau khi được thách thức với vi khuẩn V. alginolyticus, tổng mật số vi khuẩn trong nước cao nhất ở nghiệm thức đối chứng (49 ± 0,4 × 10^11 CFU/mL) kế đó là nghiệm thức 1 (40 ± 0,3 × 10^11 CFU/mL), thấp nhất ở nghiệm thức 2 (12 ± 0,02 × 10^11 CFU/mL).

Tổng số vi khuẩn trong nước thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng (1.5 ± 0.2 × 103 đến 3.6 × 0.2 108), cao nhất ở nghiệm thức 1( 2 ± 0.02 × 103 to 7.2 ± 0.2 × 108) và nghiệm thức 2 (1.6 × 103 đến 6.1 ± 0.63 × 108 CFU ml-1). Có sự khác biệt lớn giữa tổng số Lactobacillus trong nước bể chứa của nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 từ ngày 15 đến ngày 30. Sau khi được thử thách với vi khuẩn V. alginolyticus, tổng số vi khuẩn trong nước bể chứa ở nghiệm thức đối chứng cao nhất (49 ± 0.4 × 1011), tiếp đến là nghiệm thức 1(40 ± 0.3 × 1011) và thấp nhất ở nghiệm thức 2 (12 ± 0.02 × 1011 CFU ml-1).

Tổng mật số vi khuẩn vi khuẩn Lactobacillus cao hơn trong nghiệm thức bổ sung L. acidophilus (nghiệm thức 2 là 11 ± 0,23 × 10^2 CFU/mL), thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng. Đối với mật số vi khuẩn Vibrio thì ngược lại, cao nhất ở nghiệm thức đối chứng 45 ± 0,55 × 10^11 CFU/mL, trong khi ở nghiệm thức bổ sung L. acidophilus mật số vi khuẩn thấp hơn (nghiệm thức 2 là 9 ± 0,23 ×10^4 CFU/mL). Trung bình tổng mật số vi khuẩn L. acidophilus sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio đều giảm ở các nghiệm thức; tuy nhiên, tổng lượng vi khuẩn Vibrio trong ruột của tôm trong nghiệm thức cho ăn chế phẩm sinh học giảm mạnh và tăng đáng kể ở nghiệm thức đối chứng.

Kết luận

Kết quả thí nghiệm cho thấy, vi khuẩn L. acidophilus 04 rất có tiềm năng trong việc kiểm soát vi khuẩnVibrio alginolyticus gây bệnh trên tôm sú. Dòng chế phẩm sinh học này hứa hẹn sự ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ở quy mô công nghiệp, đặc biệt là sản xuất tôm.