Phương pháp mới phát hiện mầm bệnh EMS/AHPND trên tôm trực tiếp từ mẫu phân

Bệnh EMS/AHPND là một bệnh nguy hiểm trên tôm, nó có thể gây chết tôm với tỷ lệ cao lên đến 100% ở giai đoạn sớm. Bệnh EMS/AHPND được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2010 tại Trung Quốc và hiện nay bệnh này đã lan truyền ra nhiều quốc gia khác nhau trên khắp thế giới như Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Mexico và các nước khu vực Mỹ Latinh. Bệnh EMS/AHPND gây thiệt hại lên đến hơn 1 tỷ USD/năm đối với ngành công nghiệp nuôi tôm toàn cầu.

Nhiều báo cáo trước đây cho thấy nguyên nhân gây bệnh EMS/AHPND là một dòng vi khuẩn đặc biệt là Vibrio parahaemolyticus, một loài vi khuẩn phổ biến thường phát triển mạnh khi có nhiều thức ăn dư thừa hay vật chất hữu cơ tích lũy nhiều dưới đáy ao nuôi tôm. Loài vi khuẩn này có khả năng lây lan theo chiều ngang từ tôm bệnh sang tôm khỏe và cả theo chiều dọc từ tôm bố mẹ truyền sang trứng trong quá trình sinh sản. Vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND hiện diện trong hệ thiêu hóa của tôm, nghiên cứu này nhằm xác định liệu có thể phát hiện mầm bệnh EMS/AHPND trực tiếp từ mẫu phân thay vì giết chết tôm hay không?

Chuẩn đoán bệnh EMS/AHPND từ mẫu phân tôm chưa có biểu hiện bệnh

Thí nghiệm này nhằm xác định hiệu quả của việc sử dụng mẫu phân từ tôm nhiễm EMS/AHPND để xác định mầm bệnh. Sơ đồ thí nghiệm được trình bày trong Hình 1. Tôm thẻ chân trắng SPF (trọng lượng trung bình 8,5 g) được cho ăn thức ăn đã được ngâm vào dung dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPND với liều lượng 10^8 CFU/mL (liều gây chết 50%). Sau khi cho ăn, tôm được rửa qua dung dịch formalin-iodine nhằm loại bỏ mầm bệnh vi khuẩn bên ngoài tôm và sau đó chúng được chuyển sang 4 bể khác.

Hình 1: Sơ đồ các bước thí nghiệm

Mẫu phân tôm được thu trong suốt 3 ngày thí nghiệm, ly trích DNA và phân tích bằng phương pháp PCR với 2 gen độc lực mục tiêu pirAvp và pirBvp. Kết quả điện di dương tính với EMS/AHPND. Không có tôm chết trong suốt quá trình thí nghiệm. Ngoài ra, phân tích mô bệnh học cũng không phát hiện dấu hiệu tổn thương trên tôm. Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng mẫu phân để phát hiện bệnh EMS/AHPND trên tôm nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, chưa có biểu hiện bệnh lý.

So sánh độ nhạy kết quả phân tích PCR với mẫu DNA lý trích từ trực tiếp phân tôm và mẫu được nuôi tăng sinh vi khuẩn

Tôm thẻ chân trắng SPF (0,7 g/tôm) được sử dụng cho thí nghiệm cảm nhiễm với mầm bệnh EMS/AHPND trong 1 giờ và 6 giờ. Mẫu phân được thu sau 24 giờ từ mỗi thí nghiệm gây cảm nhiễm. Một phần mẫu phân được sử dụng để lý trích DNA và phân tích PCR; phần còn lại được nuôi tăng sinh vi khuẩn trên môi trường TSB+ (pha loãng với tỷ lệ 1:1000), ủ ở 28-29oC trong 6 giờ, mẫu được sử dụng trực tiếp để phân tích PCR mà không ly trích DNA.

Hình 2: Kết quả phân tích PCR. A: mẫu phân được nuôi tăng sinh vi khuẩn, B: mẫu phân trực tiếp

Kết quả cho thấy, tôm gây cảm nhiễm trong 1 giờ chết sau 4 ngày, tỷ lệ chết dồn tích 45% ở ngày thứ 6. Mười hai mẫu phân được thu và phân tích PCR, kết quả có 11 mẫu dương tính với EMS/AHPND, 1 mẫu không phát hiện. Tôm cảm nhiễm EMS/AHPND trong 6 giờ bắt đầu chết ở ngày thứ 1 và tất cả tôm chết ở ngày thứ 2. Tất cả mẫu đều dương tính với EMS/AHPND.

Ở cả hai thí nghiệm cảm nhiễm, phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND cho kết quả PCR band to và rõ hơn so với mẫu phân chưa nuôi tăng sinh vi khuẩn (Hình 2).

Nhận định

Kết quả nghiên cứu cho thấy, không phải tất cả tôm tiếp xúc với mầm bệnh EMS/AHPND đều bộc phát bệnh. Trong ao nuôi, tôm nhiễm EMS/AHPND với liều gây chết 50% có thể vượt qua và trở thành vật mang mầm bệnh (asymptomatic carriers). Phương pháp chuẩn đoán, kiểm tra mầm bệnh EMS/AHPND trước đây thường giết chết tôm để lấy mẫu gan tụy phân tích, nó không phù hợp đối với mẫu tôm bố mẹ có giá cao. Nuôi tăng sinh vi khuẩn trong mẫu phân trước khi phân tích mầm bệnh EMS/AHPND có hiệu quả cao và có thể phát hiện EMS/AHPND ở tôm sắp chết (moribund) và tôm mang mầm bệnh chưa có biểu hiện bệnh.